山東中醫藥大學楊傳華團隊發表了一項研究，題為“基于UPLC-MS探討痰濕壅盛型高血壓病小鼠血漿代謝組學特點"。研究通過檢測痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的血漿代謝組學變化，挖掘該證候的潛在生物學標志物，從整體角度闡釋痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的代謝特征。

摘要

目的：通過檢測痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的血漿代謝組學變化，分析挖掘該證候的潛在生物學

標志物，從整體角度闡釋痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的代謝特征。方法：高脂飼料喂養C57BL/6Cnc小鼠25周， 觀察小鼠一般情況和主動脈組織形態，UPLC-MS分析血漿代謝組變化，結合多維統計和單位統計分析篩選組間差 異代謝物，并進行KEGG代謝通路富集分析。結果：模型組小鼠出現痰濕壅盛證特征表現，體質量、Lee’s指數、 收縮壓、舒張壓、血糖/胰島素、瘦素水平較對照組顯著升高（P<0.05），空腹胰島素顯著降低（P<0.05），主 動脈出現明顯的形態改變和脂質沉積。UPLC-MS共篩選出差異代謝物125個（其中64個升高，61個降低；VIP>1且 P<0.05），差異最大的代謝物依次為磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿等。差異代謝物主要富集于膽堿代謝、GnRH信號通路、氨基酸的合成、FcγR介導的吞噬作用、磷脂酶D信號途徑等（P<0.01），以及產熱、EGFR信號通路、NF-κB信號通路等（P<0.05）。結論：磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿可作為痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型的特征血漿代謝標志物。

實驗材料與儀器

實驗動物：8周齡SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠27只，體質量（22±2）g

高脂飼料配方：基礎飼料83.75%，15%脂肪，1.25%膽固醇。

試劑：水合氯醛、甲醇、甲酸、水、乙腈、L-2-氯苯丙氨酸、LysoPC17:0、其他所有試劑均為分析純或色譜級。

儀器：IITC MRBP鼠尾血壓監測儀、QE高分辨質譜儀、Nexera UPLC高效液相色譜儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱、TYXH-I漩渦振蕩器、TGL-16MS臺式高速冷凍離心機。

IITC MRBP鼠尾血壓監測儀

實驗過程

小鼠一般情況觀察與模型判定：每日觀察小鼠一般情況；每周記錄小鼠體質量、身長（鼻尖至尾根），計算Lee‘s指數≡體質量（g）1/7×10/體長（cm）；每周清醒狀態下尾動脈加壓法檢測小鼠血壓，設定保溫桶溫度32℃，平衡穩定5~10min，間隔40s，連續測量3次，取平均值。25周后，以體質量、血壓均≥對照組平均值25%者作為判定“痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型"成功的標準，篩選9只納入模型組，為避免極值，再進一步淘汰此9只小鼠中體質量大和小的各1只，共納入7只模型小鼠進行后續實驗，其余淘汰過量麻醉處死。

樣本采集及主動脈組織形態觀察：25周后，10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，下腔靜脈取血，EDTA抗凝，室溫下3500r/min離心（離心半徑：7.8cm）15min，取上清液。化學法檢測小鼠空腹血糖、空腹胰島素、瘦素含量，由山東中醫藥大學附屬醫院檢驗科進行檢測。冰上分離小鼠主動脈，分為2份：一部分以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度4μm，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察組織學改變；另一部分以2.5%戊二醛固定，透射電鏡觀察主動脈亞細胞水平形態變化，電鏡樣品制備和觀察委托山東微亞生物科技有限公司進行。

血漿樣品前處理：100μL血漿加入內標（L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，均為甲醇配置）10μL渦旋震蕩10s，加入300μL甲醇-乙腈（V:V=2:1），渦旋震蕩1min，超聲提取10min，-20℃靜置30min；室溫下13000r/min離心（離心半徑：7.8cm）10min，取300μL上清液揮干，400μL甲醇-水（V:V=1:4）復溶，渦旋30s，超聲2min，室溫下13000r/min離心（離心半徑：7.8cm）10min，取上清液，以0.22μm有機相針孔過濾器過濾。質控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合而成。

液相色譜-質譜分析：采用Nexera UPLC超高效液相串聯QE高分辨質譜儀組成的液質聯用系統。色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫：45℃；流動相：A-水（含0.1%甲酸），B-甲醇；流速：0.35mL/min；進樣體積：10μL。梯度洗脫：0min時A 95%、B 5%；1.5min時A 95%、B 5%；5.0min時A 70%、B 30%；7.0min時A 30%、B 70%；10.0min時A 1%、B 99%；12.0min時A 1%、B 99%；15.0min時A 95%、B 5%。質譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。質譜參數：質量掃描范圍：60~900；分辨率（full scan）：70000；分辨率（HCD MS/MS scans）：17500；噴霧電壓：3.5kV（正離子），3.1kV（負離子）；鞘氣流速：30Arb；輔助氣流速：10Arb；毛細管溫度：320℃。

數據處理：UNIFI 1.8.1軟件用于原始數據的采集。原始數據經Progenesis QI v2.3軟件（Nonlinear Dynamics）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化。化合物的鑒定基于精確質量數、二級碎片以及同位素分布，使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN數據庫進行定性。根據化合物定性結果打分（Score）進行篩選，篩選標準為≥30分（滿分60分），將正負離子數據合并成一個數據矩陣。采用無監督的主成分分析（PCA）來觀察各樣本之間的總體分布，有監督的偏最小二乘法分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）來區分各組間的總體差異。采用七次循環交互驗證和200次響應排序檢驗（RPT）考察模型的質量，綜合對比結果，多維分析和單維分析相結合，篩選組間差異代謝物。并基于KEGG數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析，以挖掘兩組樣本中代謝途徑變化機制。

實驗結論

經高脂飼料長期喂養的小鼠，最終建立了痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型。UPLC-MS篩選出125個血漿差異代謝物，差異最大的代謝物（VIP排序）依次為磷脂酰膽堿、三氯乙醇葡萄糖醛酸、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿等。模型組小鼠血漿中多種磷脂酰膽堿水平升高，磷脂酰膽堿（16:0/0:0）升高了1.853倍，磷脂酰膽堿[0-16:1(11Z)/2:0]升高了2.513倍，磷脂酰膽堿[16:0/9:0(COOH)]升高了2.133倍，磷脂酰膽堿[22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0]升高了1.904倍。模型組小鼠多種溶血磷脂酰膽堿升高，溶血磷脂酰膽堿[18:2(9Z,12Z)]升高了2.166倍，溶血磷脂酰膽堿[18:1(9Z)]升高了2.260倍，溶血磷脂酰膽堿[20:3(5Z,8Z,11Z)]升高了3.324倍，溶血磷脂酰膽堿[18:3(9Z,12Z,15Z)]升高了2.917倍。L-異亮氨酸下調了5.128倍（1/0.195）。乙酰肉堿升高了1.960倍。痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型組與對照組比較，差異代謝物多集中于脂類小分子，磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿可作為痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的特征代謝標志物。

參考文獻

1. Tang W H, Wang Z, Levison S, et al. Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk. N Engl J Med, 2013, 368(17):1575-1584. 

2. Nie C, He T, Zhang W, et al. Branched chain amino acids: Beyond nutrition metabolism. Int J Mol Sci, 2018, 19(4):954.